爱游戏体育注册杨倩┃米根霉α-淀粉酶保守区域组氨酸突变及功能性质

发布日期: 2022-06-18 08:22:32 | 来源:爱游戏体育app 作者:爱游戏体育app官网下载

  1(安徽工程大学 生物与化学工程学院,安徽 芜湖,241000) 2(微生物发酵安徽省工程研究中心,安徽 芜湖,241000)

  摘 要有关真菌α-淀粉酶的研究主要集中在酶的底物催化形式等生化性质方面,该类酶中的大量氨基酸残基组成与酶功能性质之间的关系尚不明确。利用分子对接和同源比对等生物信息学分析方法发现米根霉α-淀粉酶中有3个特殊的组氨酸残基(H120,H200和H286),并利用定点突变的方法构建了系列突变体。性质研究表明,286位氨基酸残基结构与该酶的最适反应温度、最适反应pH、酸耐受性以及麦芽糖生成能力均有关联;突变体H286L的酸耐受性和水解淀粉的麦芽糖生成能力得到显著提高;120位和200位氨基酸残基的变化不改变该酶的最适反应温度和最适反应pH,而两者的组合突变可显著提升该酶的酸耐受性。此外,数据表明该酶的高麦芽糖生成能力与酶对麦芽三糖的亲和力不直接相关。研究结果可为真菌α-淀粉酶高麦芽糖生成能力的原因及其定向进化提供一定理论参考。

  线)指一类由真核微生物合成的在蛋白质结构和底物催化特征等方面比较相似的一类α-淀粉酶,广泛来源于曲霉属[1-3]、根霉属[4-5]和酵母属[6-7]等常见微生物菌种。与细菌α-淀粉不同,真菌α-淀粉酶可以水解淀粉和麦芽三糖,终产物中主要物质为麦芽糖及部分低聚寡糖和少量葡萄糖,在甜味剂、烘焙和啤酒酿造等领域具有广泛的应用[8]。随着糖化工艺的改进,真菌α-淀粉酶已逐渐替代β-淀粉酶作为糖化剂用于部分高麦芽糖浆(DE值:40~50)的生产,成为高麦芽糖浆生产过程中的关键酶制剂之一[9]。高麦芽糖浆品质的高低依据糖浆中麦芽糖的含量而定,所以在高麦芽糖浆的工业生产过程中真菌α-淀粉酶催化水解淀粉所生成的终产物中麦芽糖浓度的高低成为评价其应用性能的一个重要特征指标。因此,获得具有高麦芽糖生成能力的真菌α-淀粉酶并弄清其高麦芽糖生成机制是该类α-淀粉酶研究的热点问题之一。

  近年逐渐发现部分细菌来源的α-淀粉酶也具有高麦芽糖生成能力,如Bacillusstearothermophilus[10]和B.lehensis[11]来源的麦芽糖淀粉酶,Pyrococcussp.[12]和Thermococcussp.[13]来源的热稳定α-淀粉酶以及B.acidicola[14]和Lactobacillusplantarum[15]来源的耐酸α-淀粉酶等。虽然有关α-淀粉酶结构与功能关系的研究在酶催化效率、热/酸/碱稳定性及底物特异性等方面有很多报道[8-9],而有关α-淀粉酶高麦芽糖生成能力的研究则主要集中在酶的底物催化形式等生化性质方面,仅有MANAS等[11]在近期通过分子对接及分子动力学模拟等方法在蛋白质结构层面上对B.lehensis麦芽糖淀粉酶的高麦芽糖生成能力进行了研究。

  已知真菌α-淀粉酶核心催化区域具有α-淀粉酶13家族所共有的一个(α/β)8TIM桶状结构、3个关键催化位点Asp206,Glu230和Asp297(米曲霉)和4个保守区域[16]。在真菌α-淀粉酶中除了上述3个关键催化位点的功能得到研究之外,其他亚位点氨基酸尤其是保守区域内的氨基酸与蛋白质结构及其功能关系则鲜有报道,且绝大部分氨基酸残基的功能是未知的,为该类酶的结构与功能的定向进化带来了较大困难。本研究在前期工作中发现在米根霉α-淀粉酶结构的催化区域内有3个保守的组氨酸残基(H120,H200和H286),同时这些残基在其他部分真菌α-淀粉酶的氨基酸序列中也高度保守,可能与真菌α-淀粉酶家族的催化性质有密切关系。因此,本研究对该3个组氨酸残基进行了定点突变并对突变体的性质进行了分析,以期为真菌α-淀粉酶结构与功能关系研究提供理论参考。

  实验中DNA操作所涉及的各种工具酶、DNA聚合酶、T4 DNA连接酶以及质粒抽提、PCR产物纯化和胶回收等试剂盒分别购于宝生物工程(大连)有限公司或生工生物工程(上海)有限公司。PCR引物由生工生物(上海)有限公司合成,具体信息如表1所示。

  YEPD培养基(g/L):酵母粉10,胰蛋白胨20,葡萄糖20,自然pH;YEPG培养基(g/L):酵母粉10,胰蛋白胨20,半乳糖20,自然pH;YCBA培养基(g/L):酵母碳基10,乙酰胺0.3,琼脂粉15,自然pH;活性筛选培养基(g/L):酵母粉10,胰蛋白胨20,葡萄糖10,可溶性淀粉5,自然pH。

  依据ROAmy保守氨基酸分析结果,分别设计引物(表1)并利用Overlapping PCR方法[17]对ROAmy进行定点突变,PCR反应中使用引物ROAmy-F和ROAmy-R扩增基因全长序列,分别使用对应的引物引入单位点突变。PCR产物经胶回收、纯化处理后使用SalI和NotI进行双酶切并与采用同样酶切方式的质粒pKLAC1相连接并转化大肠杆菌,重组质粒经酶切和序列测定验证正确后使用SacII线性化并利用电穿孔转化法导入K.lactis,重组酵母经YCBA培养基筛选和分离纯化后分别点种活性筛选培养基,于30 ℃静置培养48 h后使用卢戈氏碘液染色,出现透明圈的菌落即为阳性重组酵母。

  以可溶性淀粉为底物测定α-淀粉酶活力,利用DNS[13]法对还原糖进行定量,以麦芽糖为标准物制作还原糖标准曲线HPO4缓冲液(0.2 mol/L, pH 5.0)混合,50 ℃温浴5 min后加入0.1 mL酶液,继续保温10 min后立即加入0.1 mL HCl溶液(0.1 mol/L)终止反应。1个α-淀粉酶活力单位(U)定义为:在上述反应条件下,每分钟生成1 mg麦芽糖所需要的酶量。

  2HPO4缓冲液(0.1 mol/L)将酶液稀释至5 U/mL并置于55 ℃水浴中保温0~60 min后测定残余酶活力。以相对残留酶活力(Ar/Ai)的对数与保温时间(t)作图[18],对曲线进行回归拟合后按公式(1)计算酶失活速率常数k,按公式(2)计算酶失活半衰期t1/2。

  米氏常数测定:分别以4、10、15、20和40 mmol/L麦芽三糖为底物在标准酶活力测定条件下反应,以生成的麦芽糖为目标产物采用Lineweaver-Burk双倒数法计算酶对麦芽三糖的米氏常数;采用相同方法,分别以0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 g/L可溶性淀粉为底物,以还原糖(以麦芽糖计)为目标产物计算酶对可溶性淀粉的米氏常数。

  [19-21]。因此,本研究以麦芽三糖为底物对ROAmy进行分子对接建模。对接结果表明麦芽三糖分子进入了ROAmy的催化反应中心区域[(α/β)8TIM-桶状结构](图1a),发现有3个组氨酸(H120,H200和H286)出现在底物附近(图1b),其中H120可与底物形成相互的氢键作用(图1c)。底物配体可与ROAmy中的多个保守氨基酸尤其是核心催化位点(Asp196和Glu220)之间形成氢键作用(图1c),表明分子对接模型具有较高的可信度。

  [16]Region I,Region II和Region V中,同时在真菌α-淀粉酶家族中高度保守(图2),因此初步选择并将该3个保守组氨酸全部替换为亮氨酸,以研究相应位点氨基酸残基组成在淀粉酶催化功能中可能存在的作用。研究中首先构建得到单突变重组体H120L,H200L和H286L,然后利用相同方法在单突变基础上进一步进行组合突变并获得重组体H120L/H200L,H200L/H286L,H120L/H286L和H120L/H200L/H286L。

  与原酶(Wild-type)相比,突变体H120L和H200L的最适反应温度没有发生明显变化(表2),突变体H286L以及含有286位组氨酸突变的突变体最适反应温度均提高了5 ℃,如H120L/H286L、H200L/H286L和H120L/H200L/H286L;同时可以发现最适反应pH也表现出了相似的规律,即突变体H286L以及含有286位组氨酸突变的突变体最适反应pH均向酸性范围偏移了0.5,而突变体H120L和H200L的最适反应pH与原酶相同。由此可知,与H120和H200相比,H286在ROAmy维持一定的催化反应温度和反应pH的过程中可能具有重要作用,但对酶的热稳定性没有影响(数据未显示)。

  酸耐受性研究显示,单突变体H120L和H200L在不同pH条件下的稳定性与原酶相似,即在其最适反应pH条件下稳定性最好;其他突变体则在pH 5.0或pH 4.5条件下具有更好的稳定性(表3)。例如,在pH 5.0条件下,H286L的半衰期(47.8 min)约为原酶的2.4倍,表明286氨基酸残基结构对维持ROAmy的pH稳定性具有重要影响。此外,在pH 4.5条件下,H200L/H286L的半衰期(66.65 min)约为原酶的6.4倍,而组合突变体H120L/H200L在pH 5.0条件下亦具有较好的稳定性,表明120和200位氨基酸残基结构对维持ROAmy的pH稳定性同样具有一定的作用。在总体趋势上,突变体H286L、H120L/H200L、H120L/H286L以及H200L/H286L的耐酸性得到了不同程度的提高,但同时在较高pH(5.5和6.0)条件下的稳定性则出现了不同程度的下降。与上述组合突变不同的是,突变体H120L/H200L/H286L的酸耐受性趋势与原酶相似,并没有出现简单的单位点突变效应累积的现象。

  Km)影响较大,而对催化速率(Vmax)的影响相对较小,且突变体作用于麦芽三糖的Km和Vmax与作用于可溶性淀粉的Km和Vmax之间没有直接关系(表4)。例如,作用于麦芽三糖时,突变体H120L/H286L和H120L/H200L/H286L的Km与原酶差异显著,而所有突变体的Vmax与原酶则没有显著差异;作用于可溶性淀粉时,除了H200L之外的其他所有突变体的Km均与原酶具有显著差异,而仅有H200L、H200L/H286L和H120L/H200L/H286L的Vmax表现出了显著的差异性,同时也表明200位氨基酸残基的结构类型对ROAmy水解淀粉的Vmax可能具有重要影响。

  以麦芽三糖为底物时,突变体H286L及含有H286突变的突变体的终产物中麦芽糖含量略高于原酶的相应产物含量,但没有达到显著差异水平(表5);当以可溶性淀粉为底物时,上述突变体的麦芽糖生成量显著高于原酶的麦芽糖生成水平(表6)。突变体H120L、H200L和H120L/H200L作用于麦芽三糖和可溶性淀粉的麦芽糖产生量与原酶均没有明显差异(表5和表6),表明286位氨基酸残基结构与ROAmy的麦芽糖生成能力之间可能具有一定的关系。

  [22]。然而,大多数市售的真菌α-淀粉酶在上述作用条件下均不稳定或催化活力低,在反应过程中必须添加更多的酶以达到生产要求,该方法显著增加了酶的使用成本。因此,提高真菌α-淀粉酶在高温或低pH条件下的稳定性或催化活力,对节约酶的用量和优化高麦芽糖浆生产工艺非常重要。本研究中发现突变体H286L及含有286位组氨酸突变的突变体在更高温度或更低pH条件下具有较高催化活力,且部分突变体的酸耐受性得到了显著提升,为真菌α-淀粉酶结构与功能的定向进化提供了一定参考。

  [19]和MCMAHON等[20]认为α-淀粉酶对麦芽三糖的低亲和力可能是Thermomonosporacurvataα-淀粉酶和Streptomycessp. α-淀粉酶具有高麦芽糖生成能力的原因之一,而DOYLE等[21]在分析了Penicilliumexpansumα-淀粉酶和A.oryzaeα-淀粉酶的麦芽糖生成能力之后则认为α-淀粉酶的高麦芽糖生成能力是由其对麦芽三糖的高亲和力所致,上述两种研究结论相悖,因此并不能确定真菌α-淀粉酶对麦芽三糖亲和力的高低是否与高麦芽糖生成能力有关;另一种研究观点认为真菌α-淀粉酶具有高麦芽糖生成能力是由于该淀粉酶可以催化低浓度麦芽三糖发生转糖基化反应,如DOYLE等[21]研究结果表明P.expansumα-淀粉酶可以在低浓度麦芽三糖(2 mmol或20 mmol)存在的条件下发生转糖基化作用,而A.oryzaeα-淀粉酶(终产物中麦芽糖含量极限值约为60% (w/w))只有在高浓度麦芽三糖(200 mmol)存在条件下才发生转糖基化作用,从而认为在低浓度麦芽三糖存在条件下能够发生转糖基化作用或在催化麦芽三糖生成麦芽糖过程中转糖基化作用为主导作用形式是P.expansumα-淀粉酶具有高麦芽糖生成能力的主要原因。

  通过比较表5和表6数据中麦芽糖的生成规律可以看出,突变体以可溶性淀粉为底物时生成的麦芽糖量与以麦芽三糖为底物时生成的麦芽糖量成正比,表明该酶的麦芽糖生成能力与该酶对麦芽三糖的作用方式相关。但是,通过比较ROAmy及其突变体性质发现各突变体的麦芽糖生产能力(表6)与其对麦芽三糖的亲和力(表4)之间并没有必然联系,如突变体H286L与麦芽三糖的亲和力约是突变体H120L/H200L/H286L与麦芽三糖亲和力的2.8倍,但是两个突变体的麦芽糖生成能力则无显著差异,这在一定程度上解释了研究中为什么会出现上述有关麦芽三糖亲和力论述的两种相悖的假设,因为真菌α-淀粉酶对麦芽三糖亲和力的高低与其高麦芽糖生成能力之间可能并不直接相关。

  基金项目:国家自然科学基金青年项目(31401630);安徽省自然科学基金(1708085QC63)

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